Descrizione
L'ALOA® Agar (Fig.1), anche noto come "Agar Listeria acc.to Ottaviani & Agosti", è un terreno di coltura che si ottiene grazie all'utilizzo della rispettiva polvere, del suo supplemento selettivo e di quello di arricchimento. Si compone, quindi, di piastre solide e flaconi che vengono utilizzati per la determinazione e il conteggio di Listeria spp. e di L. monocytogenes nei campioni della filiera alimentare (es. alimenti e mangimi).
Composizione
La composizione del terreno in polvere (da risospendere in acqua) è riportata in Tabella 1:
| Ingredienti | Quantità (g/l) |
|---|---|
| Peptone | 18,00 |
| Triptone | 6,00 |
| Estratto di lievito | 10,00 |
| Sodio piruvato | 2,00 |
| Glucosio | 2,00 |
| Magnesio glicerofosfato | 1,00 |
| Magnesio solfato | 0,50 |
| Sodio cloruro | 5,00 |
| Litio cloruro | 10,00 |
| Disodio idrogeno fosfato anidro | 2,50 |
| 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucopiranoside | 0,05 |
| Agar | 13,50 |
La composizione del Supplemento Selettivo in fiale da 500 ml è riportata in Tabella 2:
| Ingredienti | Quantità (g/500ml) |
|---|---|
| Acido nalidissico, sale sodico | 0,010 |
| Ceftazidime | 0,010 |
| Cicloeximide | 0,025 |
| Polimixina B solfato | 38,350 UI* |
La composizione del Supplemento di arricchimento in fiale da 500 ml è riportata in Tabella 3:
| Ingredienti | Quantità (g/500ml) |
|---|---|
| L-α- fosfatidilinositolo | 1,000 |
La composizione finale delle piastre pronte è quindi riportata in Tabella 4:
| Ingredienti | Quantità (g) |
|---|---|
| Peptone | 18,000 |
| Triptone | 6,000 |
| Estratto di lievito | 10,000 |
| Sodio piruvato | 2,000 |
| Glucosio | 2,000 |
| Magnesio glicerofosfato | 1,000 |
| Magnesio solfato | 0,500 |
| Sodio cloruro | 5,000 |
| Litio cloruro | 10,000 |
| Disodio idrogeno fosfato anidro | 2,500 |
| 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucopiranoside | 0,050 |
| Agar | 13,500 |
| L-α- fosfatidilinositolo | 2,000 |
| Acido nalidissico, sale sodico | 0,020 |
| Ceftazimide | 0,020 |
| Cicloeximide | 0,050 |
| Polimixina B solfato | 76700 UI* |
Le dosi indicate fanno riferimento alla "formula tipica" che il terreno possiede, ovviamente, quest'ultima può essere compensata o corretta a seconda delle esigenze specifiche e delle prestazioni che si vogliono ottenere.
Riassumendo, per preparare il terreno solido sarà, quindi, necessario partire da una polvere, da un supplemento selettivo e da un supplemento di arricchimento (Fig.2).
Metodo
Il terreno ALOA® è un terreno cromogeno e selettivo indicato per la ricerca e il conteggio di Listeria spp. e di L. monocytogenes, che sarà evidenziabile anche in presenza di flora mista. Proprio per queste sue caratteristiche, il terreno in questione risulta maggiormente efficace rispetto ad altri cromogeni dello stesso tipo (Oxford e PALCAM) e viene raccomandato dalle ISO 11290-1 e 11290-2 per la ricerca e il conteggio del genere e della specie sopracitate.
La sua azione può essere esplicata grazie alle caratteristiche dei suoi ingredienti come riportate in Tabella 5:
| Ingredienti | Ruolo nutrizionale |
|---|---|
| Peptoni ed estratto di lievito | Forniscono azoto, carbonio ed oligoelementi indispensabili per la crescita microbica. |
| Glucosio | Fornisce energia |
| Sodio cloruro | Mantiene l'equilibrio osmotico |
| Sodio fosfato bibasico | Sistema tampone del pH |
| Sodio piruvato e sali di magnesio | Stimolano la crescita di Listeria spp. |
| Ingredienti | Ruolo selettivo |
| Litio cloruro | Limita la crescita di altri microrganismi |
| Miscela antimicrobica | Limita la crescita di altri microrganismi |
Per quanto riguarda l'azione differenziale aspecifica, ovvero la possibilità di evidenziare colorimetricamente Listeria spp., è garantita dal substrato cromogenico X-glucoside che può essere degradato dall'enzima ß-glucosidasi comune a tutte le specie di Listeria. Invece, per quanto riguarda l'azione differenziale specifica, ovvero la possibilità di evidenziare colorimetricamente la sola L. monocytogenes, è garantita dal fosfatidil inositolo che è substrato per l'enzima fosfolipasi C, proprio della sola specie sopraindicata e di alcuni ceppi di L. ivanovii.
Quindi, grazie all'azione combinata degli ingredienti è possibile dire che:
L. monocytogenes presenta colonie verdi-blu con alone opaco, mentre le altre Listeria spp. presentano colonie verdi-blu prive di alone opaco (Fig.3).
Preparazione
Per preparare il terreno in polvere è necessario seguire questi passaggi (Fig.4):
- risospendere 35,3 g di polvere in 500 ml di acqua distillata fredda;
- portare ad ebolizzione mantenendo l'agitazione;
- sterilizzare in autoclave a 121°C per 15';
- addizionare il contenuto di una fiala di supplemento di arricchimento precedentemente riscaldato a 47-50°C;
- addizzionare il contenuto di una fiala di supplemento selettivo precedentemente ricostituita con 5 ml di una miscela alcol etilico/acqua sterile in rapporto 1:1 (2,5 ml di alcol e 2,5 ml di acqua sterile);
- mescolare bene il tutto;
- colare in piastre Petri sterili e lasciar solidificare.
Per preparare il terreno in flacone è necessario seguire questi passaggi (Fig.5):
- sciogliere il contenuto di un flacone (200 ml) a bagnomaria a 100°C;
- far raffreddare a 47-50°C;
- addizionare il contenuto di una fiale di supplemento di arricchimento preriscaldata a 47-50°C;
- addizionare il contenuto di una fiala di supplemento selettivo precedentemente ricostituita con 2 ml di una miscela alcol etilico/acqua sterile in rapporto 1:1 (1 ml di alcol e 1 ml di acqua sterile);
- mescolare bene;
- colare in piastre Petri sterili.
Caratteristiche
Le caratteristiche chimico-fisiche dei vari elementi (Fig.6) che permettono di ottenere il terreno sono riportate in Tabella 6:
| Elemento | Aspetto |
|---|---|
| Terreno in polvere | polvere fine, omogenea di colore beige |
| Terreno in piastra | giallo chiaro opalescente |
| Terreno in flacone | giallo chiaro opalescente |
| Supplemento selettivo | pastiglia bianca alta compatta, soluzione incolore e limpida dopo ricostituzione |
| Supplemento di arricchimento | sospensione torbida, gialla con un lieve fondo |
Procedura d'uso
Il metodo per la determinazione di L. monocytogenes e di Listeria spp. è normato dalla ISO 11290-1 e prevede un doppio arricchimento del campione con Fraser Broth.
Per questioni di praticità supponiamo che il campione da analizzare sia latte:
- arricchire il campione di latte con half-Fraser Broth in rapporto 1:10 (es. 1 ml di latte e 9 ml di brodo, oppure 25 g di campione solido in 225 ml di brodo; Fig.7);
- incubare a 30°C per 25 +/- 1 h;
- prelevare 0,1 ml del campione arricchito e seminarlo su una piastra di terreno ALOA® e su una piastra di un altro terreno cromogeno per la ricerca di Listeria (es. PALCAM od Oxford; Fig.8);
- eseguire una subcoltura prelevando 0,1 ml del campione arricchito da addizionare a 10 ml di Fraser Broth (Fig.9);
- incubare a 37°C per 24 +/- 2 h.
Metodo di conteggio
Il conteggio di Listeria spp o di L. monocytogenes può essere svolto in accordo con quanto stabilito dalle parti 1 e 2 della norma ISO 11290.
I passaggi da seguire sono (Fig. 10):
- preparare una sospensione del campione in brodo di arricchimento (es. half-Fraser broth) con o senza supplemento selettivo;
- preparare diluizioni seriali della sospensione del campione e seminare 0,1 ml di ognuna di queste sulle piastre Petri corrispondenti (90 mm di terreno ALOA®);
- se si pensa che la carica microbica possa essere molto bassa, allora, si può procedere con un inoculo iniziale di 1 ml di campione e con 1 ml per le diluzioni successive da seminare su piastre di terreno ALOA® da 140 mm;
- incubare le piastre a 37°C per 24 +/- 2 h e, se non si osserva alcuna crescita, re-incubare per altre 24 +/-2 h;
- contare le colonie nelle piastre con meno di 150 colonie (piastre da 90 mm) o con meno di 360 (piastre da 140 mm;
- confermare la crescita delle colonie con i test indicati dalla ISO 11290, previa purificazione delle colonie in Tryptic Glucose Yeast Agar.
Risultati
I risultati al termine dell'incubazione devono essere interpretati in questo modo:
- considerare come L. monocytogenes le colonie blu-verdi con alone opaco;
- considerare come Listeria spp. le colonie blu-verdi senza alone.
Inoltre, i test di conferma per L. monocytogenes che devono essere obbligatoriamente eseguiti al seguito delle analisi morfologiche e secondo quanto previsto dalla ISO 11290 sono riportati in Tabella 7:
| Tipologia test | Esito |
|---|---|
| beta-emolisi | positivo |
| L-ramnosio | positivo |
| D-xilosio | negativo |
I test di conferma facoltativi per L. monocytogenes sono riportati in Tabella 8:
| Tipologia test | Esito |
|---|---|
| Esame microscopico | bastoncelli corti e stretti o coccobacilli |
| Catalasi | positivo |
| Mobilità a 25°C | positivo |
I test di conferma obbligatori per Listeria spp. sono riportati in Tabella 9:
| Tipologia test | Esito |
|---|---|
| Esame microscopico | bastoncelli corti e stretti o coccobacilli |
| Catalasi | positivo |
mentre quelli facoltativi sono riportati in Tabella 10:
| Tipologia test | Esito |
|---|---|
| Voges-Proskauer (VP) Test | positivo |
| Mobilità a 25°C | positivo |
Se necessario, è prevista dalla norma ISO 7218 anche l'identificazione tramite panel biochimici.
Controllo qualità
Ogni lotto, prima di essere immesso sul mercato, deve soddisfare alcuni criteri di controllo qualità che sono riportati in Tabella 10:
| Ceppi di controllo | Incubazione (°C,h,ATM) | Specifiche |
|---|---|---|
| L. monocytogenes ATCC 13932 | 37°C /24- 48h A | colonie verdi-azzurre con alone opaco con A/C* ≥ 0,5 |
| L. monocytogenes ATCC 7973 | 37°C /24- 48h A | colonie verdi-azzurre con alone opaco con A/C* ≥ 0,5 |
| L. innocua ATCC 33090 | 37°C /24- 48h A | colonie verdi-azzurre, senza alone |
| L. ivanovii ATCC 19119 | 37°C /24- 48h A | colonie verdi-azzurre, con o senza alone |
| E. coli ATCC 25922 | 37°C /48h A | nessuna crescita (100% inibizione) |
| E. faecalis ATCC 19433 | 37°C /48h A | nessuna crescita (100% inibizione) |
Limitazioni
Quando sulle piastre la crescita risulta molto abbondante, è possibile comparare l'opacità della piastra al centro con quella ai bordi dove non è possibile che si sviluppino bene i microrganismi, oppure con una piastra non seminata.
Comunque, una piastra con L. monocytogenes presenterà una spiccata opacità che sarà del tutto assente in quelle con solo Listeria spp.
Inoltre, L. ivanovii entro le prime 24 h di crescita presenta colonie verdi-azzurre con alone opaco esattamente identiche a quelle di L. monocytogenes.
In questo caso, è assolutamente consigliabile far affidamento su altri test di indentificazione biochimica.
E' stato riportato che alcune specie di sei generi di batteri riescono, comunque, a crescere sul terreno generando colonie blu-bluastre; si tratta di: Bacillus spp. (B. circulans, B. clausii, B. licheniformis, B. oleronius), Cellulosimicrobium funkei), Enterococcus spp. (E. faecalis, E. faecium/durans), Kocuria kristinae, Marinilactibacillus psychrotolerans, Rothia terrae, Staphylococcus spp. (S. sciuri, S. saprophyticus subsp. saprophyticus/xylosus), Streptococcus spp.
Infine, alcuni ceppi di L. monocytogenes possono svilupparsi lentamente a seguito di stress, con ritardata produzione di fosfolipasi C con il conseguente alone opaco.
Precauzioni e modalità di conservazione
I prodotti che sono stati descritti sono utili per controlli microbiologici, sono indicati esclusivamente per uso professionale e devono essere impiegati in laboratori dedicati e con personale addestrato per i metodi di asepsi e per le procedure di sicurezza legate ai patogeni.
Le modalità di conservazione sono riportate in Tabella 11:
| Oggetto | Conservazione |
|---|---|
| Terreno in polvere | Conservare a +2°C /+8°C al riparo della luce e dell’umidità, fino a scadenza |
| Supplemento selettivo liofilo | Conservare fino alla data di scadenza indicata sull’etichetta, a 2-8 °C. Una volta ricostituito, il supplemento deve essere usato in giornata. |
| Supplemento liquido | Conservare fino alla data di scadenza indicata sull’etichetta, a 2-8 °C. Non utilizzare oltre questa data. Aprire il flacone dell’arricchimento liquido con le precauzioni dell’asepsi e, se il contenuto non fosse utilizzato completamente, conservare a 2-8°C fino alla data di scadenza. |
| Piastre monouso | Conservare nella confezione originale a 2-8°C al riparo dalla luce diretta. In queste condizioni il prodotto è valido fino alla data di scadenza indicata in etichetta. Dopo l’apertura del sacchetto di plastica, le piastre possono essere usate entro 7 giorni, se conservate in ambiente pulito a 2-8°C. |
| Flaconi pronti all'uso | Conservare nella confezione originale a 2-8°C al riparo dalla luce diretta. In queste condizioni il prodotto è valido fino alla data di scadenza indicata in etichetta. |
Fonti
Crediti testo
- Scheda Tecnica Biolife;
- Ottaviani, F., Ottaviani, M., Agosti, M. (1997) Differential agar medium for Listeria monocytogenes. Quinper Froid Symposium Proceedings, P6 A.D.R.I.A. Quinper (F) 16-18 June, 1997;
- SO 11290-1:2017. Microbiology of the food chain - Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes and of Listeria spp. - Part 1: Detection method.
- ISO 11290-2:2017. Microbiology of the food chain - Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes and of Listeria spp. - Part 2: Enumeration method.
Crediti immagini
- Immagine di copertina: Biolife Cromogeni;
- Figura 1: Biolife Cromogeni;
- Figura 2: Kairosafe, Sigma Aldrich;
- Figura 3: Biolife Cromogeni;
- Figura 4: BiosLogos;
- Figure 5-6-7-8-9: BiosLogos;
- Figura 10: Giulio Fenu.