Principio del test

Svariati batteri hanno la capacità di fermentare i carboidrati, nello specifico, gli zuccheri.
Siccome certi batteri fermentano alcuni zuccheri che non vengono fermentati da altri, questo aspetto può essere sfruttato come marcatore per la loro identificazione biochimica.
Il Triple Sugar Iron Test (TSI; Fig.1) si basa proprio su questo, ovvero, sulla capacità di determinati microrganismi di fermentare zuccheri producendo idrogeno solfato.
Per questo test è perciò sfruttato un terreno di coltura contenente un colorante sensibile al pH come indicatore (rosso fenolo), un 1% di lattosio, 1% di saccarosio, 0,1% di glucosio con, in aggiunta, sodio tiosolfato, solfato ferroso e solfato ferroso ammonico (sale misto di ammonio e ferro II dell’acido solforico).
Il terreno in questione viene generalmente colato in un tubo e fatto solidificare con superficie inclinata, in questo modo, si otterrà una più ampia interfaccia più (parte alta – aerobiosi) o meno (parte interna – anaerobiosi) esposta all’ossigeno atmosferico.

Nello specifico ...

La fermentazione degli zuccheri porta alla liberazione di acidi che inducono un viraggio del rosso fenolo verso il giallo.
Per facilitare il rilevamento dei microrganismi che utilizzano esclusivamente il glucosio come fonte nutrizionale, quest’ultimo è aggiunto al terreno con una concentrazione dieci volte inferiore rispetto agli altri zuccheri.

Quando il glucosio viene consumato, nella parte interna del terreno dove vigono condizioni di anaerobiosi, i prodotti acidi determinano semplicemente un viraggio del colorante verso il giallo. Al contrario, nella parte esterna del terreno dove vigono condizioni di aerobiosi, terminato il glucosio, si passa all’utilizzo del peptone con liberazione di prodotti alcalini (ioni ammonio) con viraggio del rosso fenolo verso il rosso scuro.
Esaurito il glucosio, perciò, solo i microrganismi capaci di utilizzare gli altri zuccheri potranno indurre reazione acida anche nella parte esterna del terreno rendendolo giallo.
Inoltre, se i batteri in questione sanno metabolizzare anche il sodio tiosolfato del terreno, sarà liberato idrogeno solforato (H₂S) che, in presenza di ferro ammonio solfato, precipiterà sotto forma di ferro solfuro dal tipico colore nero.
L’eventuale produzione di gas come prodotto della fermentazione può indurre, infine, la formazione di bolle o rotture/crepe visibili sul terreno.

Composizione e preparazione

Il terreno di coltura utilizzato per il Triple Sugar Iron Test è così composto:

• Digerito enzimatico di caseina (5 g);
• Digerito enzimatico di tessuti animali (5 g);
• Peptone arricchito con lievito (10 g);
• Glucosio (1 g);
• Lattosio (10 g);
• Saccarosio (10 g);
• Citrato ferrico di ammonio (0,2 g);
• Cloruro di sodio (5 g);
• Sodio tiosolfato (0,3 g);
• Rosso fenolo (0,025 g);
• Agar (13,5 g);

Questa è la formula per 1000 mL con pH di 7,3.

Per la preparazione è necessario sospendere 64,4 g di polvere in un litro di acqua distillata.
Successivamente, si riscalda il tutto (fino all’ebollizione) e lo si mescola fino alla completa dissoluzione delle polveri. Il terreno deve essere poi colato in tubi da microbiologia e autoclavato a 121°C per 15 minuti. Al termine della preparazione, va fatto raffreddare con superficie inclinata e con un’altezza di circa 2 cm.

Metodo

Con un’ansa sterile è necessario prelevare alcune colonie ben isolate del microrganismo di interesse precedentemente coltivato su un terreno di coltura di supporto.
Il campione deve essere seminato strisciando l’ansa dalla parte centrale del terreno verso la parte esterna e più inclinata.
Il tubo deve essere chiuso in maniera blanda per permettere una minima entrata di ossigeno, e poi deve essere incubato a 35-37°C per 18-24 h.

Il test è utilizzato nei laboratori per il differenziamento dei membri della famiglia delle Enterobacteriaceae da altri batteri Gram negativi.
Inoltre, è ampiamente sfruttato anche per un differenziamento interno alla famiglia e basato sul differente metabolismo degli zuccheri.

Risultati attesi

I risultati attesi sono riportati in Tabella 1:

Risultati	Interpretazione
Terreno rosso/giallo	Fermentazione glucosio e catalizzazione peptone
Terreno giallo/giallo	Fermentazione glucosio e lattosio e/o saccarosio
Terreno rosso/rosso	No fermentazione e catalizzazione peptone
Terreno giallo/giallo con bolle	Fermentazione glucosio e lattosio e/o saccarosio, con produzione di gas
Terreno rosso/giallo con bolle	Fermentazione glucosio e catalizzazione peptone, con produzione di gas
Terreno rosso/giallo con bolle e precipitato nero	Fermentazione glucosio e produzione di idrogeno solforato
Terreno giallo/giallo e precipitato nero	Fermentazione glucosio e lattosio e/o saccarosio, con produzione di idrogeno solforato
Nessun cambiamento/nessun cambiamento	Nessuna fermentazione

Immagini

I risultati presentati nella Tabella 1 sono visibili nelle Fig. 2 e 3 sottostanti:

Limitazioni del test

E’ sempre raccomandabile consigliare ulteriori test biochimici, spettrometrici e immunologici per una completa e sicura identificazione dei microrganismi.
Quando si semina il campione è assolutamente importante farlo dalla parte più interna verso quella più esterna del terreno, senza dimenticarne delle parti: questa dimenticanza può invalidare il test. I risultati devono essere osservati tra le 18 e le 24 h dall’incubazione: osservarli troppo presto può comportare falsi positivi, mentre osservarli troppo tardi dei falsi negativi.
Va inoltre specificato che per il rilevamento della produzione di idrogeno solforato esistono dei terreni decisamente più sensibili ed adatti, ad esempio, il Sulfide Indole Motility Medium.

Altro aspetto da considerare è che la produzione di idrogeno solforato potrebbe mascherare la reazione acida nella parte interna del terreno. Tuttavia, la produzione di idrogeno solforato richiede un ambiente acido e perciò si considera la reazione ugualmente positiva.
Alcune specie o alcuni ceppi possono essere incapaci di fermentare carboidrati su questo mezzo (pur avendone le capacità).

Controllo qualità

I risultati da controllare, riportati in Tabella 2, sono relativi ad un TSI agar incubato a 37°C per 24 h in condizioni di aerobiosi (secondo quanto previsto dalla ISO 19250):

Microrganismo	Crescita	Aspetto parte esterna	Aspetto parte interna	H2S	Gas
Escherichia coli ATCC 25922	Buona	Giallo	Giallo	–	+
Proteus vulgaris ATCC 13315	Buona	Giallo	Giallo	+	+
Salmonella enteritidis ATCC 13076	Buona	Rosso	Giallo	+	+
Shigella flexneri ATCC 12022	Buona	Rosso	Giallo	–	–
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027	Buona	Rosso	Rosso	–	–

Fonti

• Microbiology Info.com;
• Wikipedia – Triple Sugar Iron Test;
• Tille P.M. 2014. Bailey and Scott’s diagnostic microbiology. Thirteen edition. Mosby, Inc., an affiliate of Elsevier Inc. 3251 Riverport Lane. St. Louis. Missouri 63043;
• labkem – Sceda tecnica.
  
  

Crediti immagini

• Immagine in evidenza: keywordteam.net;
• Figura 1: microbiologyinfo.com;
  • Figura 2: onlinebiologynotes.com;
  • Figura 3: Chegg.
    
    

Crediti tabelle

• Tabella 1: microbiology Info.com.
  • Tabella 2: labkem – Sceda tecnica.

Crediti video: approfondimento

• Video 1: TSI – Microbiology Lab;

Video 2: TSI – MLTLecture.