Bismuth sulfide agar

Perchè si usa?

Il Bismuth Sulfite Agar (Fig.1) è un terreno altamente selettivo che viene impiegato per l’isolamento di Salmonella spp., nello specifico per Salmonella typhi in alimenti o in campioni clinici.
La salmonellosi, infatti, rappresenta ancora un problema globale nonostante gli sforzi fatti per controllarne la prevalenza tra i capi di bestiame.
Inoltre, se le salmonellosi non tifoidee provocano sintomi blandi, quelle provocate da sono associate a febbre alta, mal di testa, dolore addominale, problemi respiratori ed epatici, e danni neuronali.
La diffusione del patogeno che spesso provoca anche disturbi intestinali, è generalmente dovuta al consumo di alimenti crudi o mal cotti.

Figura 1

Bismuth Sulfite Agar con colonie di S. typhi.
[Fonte: diatek.com.tr]

Come funziona?

Bismuth Sulfite Agar è un terreno di coltura per l’isolamento selettivo di Salmonella spp., perfezionato da Wilson e Blair.
I microrganismi tifoidei derivanti da matrici alimentari, da feci, urine o altri materiali infetti, crescono vigorosamente sul terreno formando colonie nere piuttosto evidenti.
Al contrario, i batteri Gram positivi e svariati coliformi vengono inibiti.
Questa attività inibente, oltre a favorire il riconoscimento specifico, permette di poter utilizzare un maggior quantitativo di inoculo rispetto al passato. Inoculi di più grande volume, conseguenzialmente, permettono l’identificazione e il rilevamento dei microrganismi anche quando gli stessi sono poco presenti all’interno del campione.
Per l’isolamento di Salmonella spp. è necessario preparare un brodo di arricchimento a partire dal campione, per poi seminarne 10 mL sul terreno di coltura.
Quest’ultimo va poi incubato per 24-48 h a 35°C.

Composizione del terreno

Nel Bismuth Sulfite Agar, l’estratto di manzo e il peptone forniscono azoto, vitamine e minerali, mentre il destrosio rappresenta un’ottima fonte di energia per i microrganismi. Il disodio fosfato è un tampone, mentre il bismuto solfato e il sono inibitori della crescita dei batteri Gram positivi e dei coliformi.
Tutti questi ingredienti (Tabella 1), al contrario, favoriscono un crescita vigorosa di Salmonella spp.
Il solfato ferroso è utile per evidenziare la produzione microbica di H2S.
Quando quest’ultime è presente, infatti, il ferro precipita conferendo alle colonie di Salmonella spp. il tipico colore nerastro/bruno con riflessi metallici.
L’agente solidificante utilizzato è l’agarosio.

Tabella 1
Formula per la preparazione del terreno Bismuth Sulfite Agar, con correzione per “l” di volume.
[Fonte: Bismuth Sulfite Agar BD]

Preparazione terreno

Per la preparazione del Bismuth Sulfite Agar è necessario seguire questi passaggi:

1) Sospendere 52 g totali di reagenti in 1 L di acqua deionizzata, successivamente mescolare.

2) Riscaldare in agitazione fino ad ebollizione per 1 minuto, fino a quando la polvere non si scioglie completamente (NON AUTOCLAVARE).

3) Il terreno va utilizzato il giorno stesso in cui viene preparato.

Risultati della crescita

Le colonie di S. typhi hanno generalmente colorazione nerastra con un alone circostante dal nero al marrone scuro, con dimensioni anche considerevolmente superiori rispetto alla colonie formante. Questo alone, se esaminato alla luce solare, appare metallico e cangiante.
Quando le piastre sono densamente colonizzate da S. typhi, questo effetto può non essere visibile, tuttavia, osservando la zona sarà possibile osservare delle piccole colonie bordate di verde brillante. Le salmonelle non tifoidee producono colonie dal nero al verde con un alone scuro limitato o addirittura assente.
Solitamente, Shigella spp., S. flexneri e S. sonnei sono inibite, ma in caso formassero colonie, queste sarebbero da marroni a verdi, con depressione centrale simile ad un cratere.
Escherichia coli generalmente viene inibito, ma se si sviluppa forma colonie dal marrone al verde e senza riflesso metallico.
Pochi ceppi di Enterobacter aerogenes possono svilupparsi sul terreno mostrando colonie dall’aspetto mucoso, gli altri Enterobacter possono formare colonie dall’aspetto argenteo e con riflesso decisamente meno intenso di quello di S. typhi.

Immagini

Le colonie di S. typhi su Bismuth Sulfite Agar appaiono come nella Fig.2 e nella Fig.3 sottostante:

Figura 2
Bismuth Sulfite Agar privo di colonie (Uninoculated Plate), con colonie di S. typhi ATCC 19430 (in alto a dx) e con colonie di S. typhimurium ATCC 14028 (in basso).
[Fonte: Bismuth Sulfite Agar BD]

Figura 3
Colonie di S. typhi con tipico alone scuro circostante.
[Fonte: pin on bacteriology practical 1]

Limitazioni del terreno

Quando si utilizza questo tipo di terreno è necessario conoscere anche le sue limitazioni:

E’ sempre utile isolare bene le colonie, infatti, una densità di crescita troppo elevata rende le colonie di S. typhi verdi pallide e difficile da identificare come tali.

Le colonie sviluppatesi su questo terreno potrebbero essere dovute alla presenza di altri microrganismi che, per essere identificati, dovranno essere subcolturati su altri terreni meno selettivi (es. MacConkey Agar).

Le colonie di S. typhi solitamente si sviluppano già dopo 24 h, tuttavia, è sempre opportuno incubarle per 48 h per permettere la crescita di altri ceppi tifoidei.

Il terreno non va autoclavato, il riscaldamento dei reagenti per un periodo superiore a quanto previsto ne provoca un danno con conseguente perdita di selettività.

Fonti

Bismuth Sulfite Agar BD

Flowers, Andrews, Donnelly and Koenig. 1993. In Marshall (ed.), Standard methods for the examination of dairy products, 16th ed. American Public Health Association, Washington, D.C.

Wilson and Blair. 1926. J. Pathol. Bacteriol. 29:310.

U.S. Food and Drug Administration. 2001. Bacteriological analytical manual, online. AOAC International, Gaithersburg, Md.

Crediti tabelle

Bismuth Sulfite Agar BD

Crediti immagini

Immagine in evidenza: dongnalab.com

Figura 1: diatek.com.tr

Figura 2: Bismuth Sulfite Agar BD

Figura 3: pin on bacteriology practical 1

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