Principio
Composizione e preparazione
La cisteina permette lo sviluppo di colonie localizzate di coliformi mentre la carenza di elettroliti blocca lo sciamaggio delle differenti specie di Proteus che, in questo modo, possono essere valutate quantitativamente come altri patogeni urinari.
La formula per litro d’acqua purificata del CLED agar è riportata in Tabella 1:
Tabella 1
Formula del CLED agar
[Fonte:
BD Scheda Tecnica]
Il pH del mezzo dovrebbe essere di 7,3 +/- 0,2, e la formula può essere corretta in base alle esigenze dei criteri di performance.
Metodo
Si procede quindi recuperando un campione di urina non diluita e ben mescolata con anse da 0,01-0,001 ml. L’urina deve essere prelevata con metodica sterile e seminata non oltre le 2 ore dal suo prelievo se non refrigerata. Se refrigerata può essere utilizzata entro, e non oltre, le 24 h dal prelievo per evitare lo sviluppo di microrganismi contaminanti.
Il campione va poi seminato facendo una riga al centro della piastra, riga da cui si può diffondere ulteriormente l’inoculo.
Il terreno va incubato a 35 +/- 2°C in atmosfera aerobia. Dopo 18-24 h sarà possibile verificare la crescita, la pigmentazione, il colore delle colonie e l’inibizione dello swarming di Proteus spp.
Risultati e immagini
Tabella 2
Risultati della crescita di diversi
microrganismi su CLED agar
[Fonte: BD
Scheda Tecnica]
Le immagini corrispondenti sono visibili in Fig. 2, 3 e 4:
Figura 2
Immagine esemplificativa del viraggio
del blu di bromotimolo del CLED agar: a sinistra nessun viraggio in
presenza di P. vulgaris, mentre a destra è visibile un
viraggio verso il giallo dovuto alla fermentazione del lattosio di E.
coli
[Fonte: FC
GUBKIN]
Figura 3
CLED agar senza viraggio di colore e
sciamaggio tipico di Proteus spp.
[Fonte: datuopinion.com]
Figura 4
Aspetto del CLED agar in presenza di
Klebsiella pneumoniae.
Come riportato in Tabella 2,
terreno giallastro con colonie gialle-blu e mucose
[Fonte: Flickr]
Calcoli e interpretazione dei risultati
Se viene utilizzata un’ansa da 0,01 ml, ogni colonia risultante rappresenterà 100 CFU/ml di urina.
Se viene utilizzata un’ansa da 0,001 ml, ogni colonia risultante corrisponderà a 1000 CFU/ml di urina.
Le linee guida correnti suggeriscono che, per singolo isolato, una densità >/= di 105 indica un’infezione, mentre una densità inferiore a 105 CFU/ml indica una contaminazione uretrale/vaginale.
I microrganismi contaminanti generalmente sono presenti in numero piuttosto basso e con morfologia delle colonie decisamente diversa tra di loro.
Limitazioni
Gli streptococchi e altri microrganismi che richiedono la presenza di siero per svilupparsi, potrebbero non crescere a sufficienza sul CLED agar, o comunque necessitare di un passaggio di coltura anteriore in agar sangue.
Alcuni patogeni genito-urinari, come Neisseria gonorrhoae, Gardnerella vaginalis, Chlamydia, Ureaplasma e altri microrganismi fastidiosi, non si sviluppano su questo terreno di coltura.
Tra l’altro, nonostante il viraggio del colorante dovuto alla fermentazione del lattosio possa essere utilizzato per discriminare differenti microrganismi, è sempre consigliabile apportare altri test (biochimici e sierologici) per ottenere una piena conferma.
Controllo qualità
Tabella 3
Microrganismi per il controllo qualità
con aspetto delle colonie
[Fonte: BD
Scheda Tecnica]
Anche per il controllo qualità, le piastre vanno incubate a 35 +/- 2°C in atmosfera aerobia. Devono essere controllate dopo 18-24 h per verificare la crescita, la pigmentazione, la dimensione delle colonie e l’inibizione dello sciamaggio di Proteus spp.